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动物尿中盐酸仑特罗残留量的检测方法
中国农业网 2004-5-6 15:34:22 信息来源：
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    1范围
    本标准规定了动物尿液中盐酸克仑特罗残留量的测定方法。
    本标准适用于动物尿液中盐酸克仑特罗残留量的检定。

    第一篇  酶联免疫吸附法

    2原理
    利用固相酶联免疫吸附原理，将盐酸克仑特罗特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入稀释的尿样（未知抗原）及酶标盐酸克仑特抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免品中盐酸克仑特罗多，则被抗体结合酶标盐酸克仑特罗抗原少，颜色，反之则深。用目测法或仪器法与盐酸克仑特罗标样比较来判断样品中盐酸克仑特罗的含量。

    3试剂和材料
    除方法另有规定外，试剂均为分析纯，水为二次重蒸水或超纯水。
    3.1盐酸克仑特罗酶联免疫试剂盒：德国Rbiopharm公司生产或类似产品。

    4仪器与设备
    4.1酶标测定义，含有450nm的滤光片。
    4.2微量连续可调移液器及配套吸头：（10-200）μL。
    4.3冰箱：4℃-8℃。
    4.4离心机：0-10000rpm。

    5试样制备
    取尿样1ml，400rpm离心10min，取上清液测定

    6测定步骤
    6.1试剂盒和待检样品检测前平衡至室温（19℃-25℃）.
    6.2每个微孔加入100μl反应终止液，混匀后在酶标仪450nm处读取吸光度值。

    6.3倒出微孔中液体，250μl蒸馏水洗涤3次，拍干，加入20μl标准液或处理好的样品（标准和样品做两个平行试验），再加入100μl稀释的酶标记物，充分混匀，室温孵育30min；
    6.4倒出微孔中液体，250μl蒸馏水洗涤3次，拍干，加入50μl基质和50μl发色剂，充分混匀，室温暗处孵育15min；
    6.5加入100μl反应终止液，混匀后在酶标仪450nm处读取吸光度值。

    7结果计算
    7.1计算标准品和样品的平均吸光值
    7.2以标准浓度的对数值为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准工作曲线，即为盐酸克仑特罗测定值。
    7.3以样品吸光值在标准工作曲线上查出相对浓度，乘以样品稀释倍数。

    8灵敏度
    本方法的检测限为100ng/L。

    9其他
    9.1试剂盒应放在4℃-8℃冰箱内保存。
    9.2为分析人员安全，操作时要戴止医用乳胶手套。

    第二篇  气相色谱—质谱联用法

    10原理
    样品用β—盐酸葡萄糖醛甙酶或芳基硫酸酯酶在pH5.2的缓冲溶液中消化。萃取液用C18.和SCX小柱、固相萃取净化，分离的药物残留经过双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后，用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。

    11试剂
    11.1乙酸铵缓冲液（20mmol/L，pH5.2）：1.45g乙酸铵溶解于（500-700ml）水中，用乙酸调整pH值为5.2并稀释到1升。
    11.2β—盐酸葡萄糖醛甙酶或芳基硫酸酯酶溶液30U/ml或相当者。
    11.3 30mllmol/L盐酸：30mllmol/L盐酸稀释到1升蒸馏水中。
    11.4甲醇：分析纯。
    11.5 4％氨化甲醇（amonium methanol）：用甲醇稀释4ml氨溶液（比重0.88）至100ml。
    11.6双三甲基硅基三氟乙酰胺，BSTFA。
    11.7甲苯：分析纯。
    11.8乙酸乙酯—异丙醇（6：4）：分析纯。
    11.9 C18小柱：supelclean LC—18Sep Pak小柱500mg，3ml。
    11.10SCX小柱：supelcleanLC—18Sep Pak小柱500mg，3ml。
    11.11标准溶液
    11.11.1盐酸克仑特罗储备液：精确称取盐酸克仑特罗标准品，用氨化甲醇配成浓度约1mg/ml的标准储备液。
    11.11.2盐酸克仑特罗标准工作液：将储备用氨化甲醇稀释为（0.05-2.0）μL/ml，存放在冰箱中备用。

    12仪器及设备
    12.1离心瓶，具塞，50ml。
    12.2Sep—Pak真空接头。
    12.3具聚四氟乙烯拧盖的试管。
    12.4酸度计。
    12.5机械真空泵。
    12.6旋涡混合器。
    12.7恒温箱，37℃±3℃。
    12.8恒温箱，80℃±3℃。
    12.9恒温箱，100℃±3℃。

    13试验步骤
    13.1提取：用移液管移取5.00ml尿样于50ml具塞的离心管中，用乙酸调整pH值至5.2，加入20mmol/l的乙酸铵缓冲溶液1ml，加入50μL盐酸葡萄糖醛甙酶溶液，拧紧盖子，超声15分钟，于37℃下酶解18hr。加入10ml乙酸乙酯一异丙醇混合液，震荡15分钟，用滴管收集有机相，用10ml上述温合液重复提取一次，合并两次提取的溶液于一玻璃试管中用氮气吹干。用1ml 20mmol/l的乙酸铵缓冲溶液溶解。
    13.2净化
    装好真空泵和接管，将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 30mmol/l盐酸活化。取0.01mL滤液至C18柱中，用1ml 20mmol/l的乙酸铵缓冲溶液冲洗试管并一起转移至C18柱中，依次用5mL水、5mL甲醇淋洗柱子，在溶剂流过固相萃取柱后，保持抽气5分钟使柱中的液体逐渐枯竭，取下C18柱，用5mL4％氨化甲醇淋洗SCX柱并集流出液于具塞破璃试管中。
    13.2衍生化
    用氮气吹干上述流出液，用100μL甲苯溶解残渣，加入100μLBSTFA，加盖并旋涡混合器上震荡，在80℃的烘箱中加热1小时。蒸干多余的溶剂，用0.50mL甲苯溶解，取适量的盐酸克仑特罗标准工作液，同时衍生化，用气质联用仪选择离子监测方式检测。
    13.4检测
    13.4.1气相色谱条件
    13.4.1.1色谱柱：HP-5MS5％苯基甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm（内径），0.25μm（膜厚）；
    13.4.1.2进样口：220℃；
    13.4.1.3进样方式：不分流；
    13.4.1.4进样体积：2μL；
    13.4.1.5柱头压70℃：7.5psi；
    13.4.1.6样温：70℃（保持0.6分钟），以25℃/分钟升温至200℃（保持6分钟），以25℃/分钟升温至280℃（保持5分钟）；
    13.4.17载气：氦气，流速：0.9mL/分钟（恒流）。
    13.3.2质谱条件
    13.4.2.1GC/MS传输线温度：280℃；
    13.4.2.2溶剂延迟：8分钟；
    13.4.2.3EM电压：高于调谐电压200V。
    13.4.2.4分析器温度：230℃；
    13.4.2.5四极杆温度：106℃；
    13.4.2.6选择离子监测：（M/Z）86，243，262，277。
    13.5测定
    根据样口液中盐酸克仑特罗含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品液等体积参插进样测定。
    定性：样品峰与标栗的保留时间之差不多于3秒，Q值应大于80，当Q值小于80时，应通过人工比较选择离子的丰度，以基峰百分数表示。
    13.6计算

            X=h×Cs×V÷Hs×m

    式中：X—试样中克仑特罗残留含量，mg/kg；
          h—样液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高，mm；
          hs—标准工作液中经衍生化盐酸克仑特罗的峰高，mm；
          Cs—标准工作液中盐酸克仑特罗的浓度，μg/ml；
          V—样液最终定容体积，ml；
          m—最终样液所代表的试样量，s。
    注：计算结果需将空白值扣除。

    14精密度和灵敏度
    在上述色谱条件下，本方法的检测限为5μl/kg，回收率为80％±1％。
本信息仅供参考，使用前请核实。